Métodos de reemplazo a las pruebas con animales

La toxicología ha sido una herramienta fundamental en la toma de decisiones de salud pública para la regulación de químicos tóxicos. Desde hace décadas se han utilizado ensayos toxicológicos basados en experimentación animal, los cuales poseen numerosos inconvenientes en cuanto a las diferencias fisiológicas que poseen los animales modelo respecto a humanos, largos tiempos de implementación, altos costos asociados y problemas éticos. Debido a estas desventajas, y a la prohibición del uso de experimentación animal en estudios cosméticos de parte de la Unión Europea, se han desarrollado métodos alternativos (ensayos in silico, in vitro, uso humanos voluntarios o estrategias integradas). Estos modernos métodos predicen de manera efectiva la respuesta humana a distintos tóxicos, evitando o reduciendo el uso de animales en tests. Además poseen ventajas técnicas; permiten comprender y representar de mejor manera los mecanismos de toxicidad en humanos, prácticas; al ser más rápidos y reproducibles, y económicas; reduciendo costos de implementación y mantención. Actualmente se han validado métodos alternativos en las áreas de irritación y corrosión cutánea, penetración cutánea, fototoxicidad, toxicidad sistémica aguda, irritación ocular y genotoxicidad (tanto de reemplazo completo o parcial de uso de animales). Para parámetros más complejos, como carcinogenicidad o toxicocinética, existen diversos métodos en proceso de validación que utilizan estrategias integradas de experimentación.

Métodos de reemplazo usados actualmente para el área cosmética.

Métodos In Silico

Los métodos in silico están basados en computadores, utilizan información proveniente de bases de datos o modelos computacionales, en vez de realizar experimentos in vivo. Entre los métodos in silico normalmente utilizados se encuentran:

  • Agrupación de sustancias y extrapolación (“read-across”): La primera se refiere a técnicas de agrupación de químicos según sus propiedades fisicoquímicas, toxicológicas y ecotoxicológicas para su evaluación, mientras que “read-across” se refiere a la técnica que permite predecir las propiedades o efectos de una sustancia no testeada mediante la extrapolación de información de una sustancia similar ya testeada, evitando así la necesidad de realizar experimentos con cada sustancia para cada parámetro (EURL-ECVAM, 2013; Raunio, 2011).
  • QSAR (quantitative structure-activity relationship): Modelos que relacionan de manera cuantitativa las propiedades químicas de un compuesto (estructura molecular) con propiedades físicas o con efectos biológicos (variables toxicológicas), dando información sobre el peligro de una sustancia (OECD, 2015).

Son utilizados actualmente en las áreas de irritación y corrosión cutánea, irritación ocular, sensibilización cutánea, toxicidad sistémica aguda, genotoxicidad y mutagenicidad, carcinogenicidad, disrupción endocrina y toxicocinética. (Raunio, 2011;Worth y col., 2014)

Existen diversos programas computacionales que integran estos enfoques para predecir los efectos adversos de una sustancia, tales como: TIMES-SS, Toxtree, the OECD QSAR Toolbox, Derek Nexus, TOPKAT, Molcode, QSARModel, y Multi-CASE (ECHA 2008; Worth y col., 2014).

Aunque han habido grandes avances técnicos en los métodos in silico y a pesar  de que son usados de manera rutinaria, actualmente ninguno ha sido aceptado internacionalmente como método de reemplazo total (Raunio, 2011).

Estudios con humanos voluntarios

  • Microdosing: Este método utiliza técnicas analíticas ultrasensibles (Espectrometría de masa con acelerador o Cromatografía líquida) y consiste en la introducción de pequeñas dosis (microdosis) de una sustancia en un sujeto para evaluar su actividad en el cuerpo humano. Se utilizan como estudios preclínicos (“fase cero”) permitiendo ahorrar tiempo, dinero, reducir el número de animales de experimentación, y han probado ser muy precisos. Se espera que dentro de los próximos años sean usados de manera amplia para ensayos en etapas tempranas. (Anderegg y col., 2006; Arora y col., 2011; Tewari T y Mukherjee 2010).
  • Imaging: Técnicas no invasivas que permiten visualizar el cuerpo humano, como imagen de resonancia magnética (MRI) o tomografía por emisión de positrones. Son utilizadas para analizar la cinética y comportamiento dinámico de compuestos, por ejemplo en estudios de irritación cutánea o toxicidad sistémica por administración repetida (Adler y col., 2010; Arora y col., 2011; EURL-ECVAM, 2013; Worth y col., 2014).

Estrategias de experimentación integradas (Integrated testing strategies ITS)

Basadas en la combinación de métodos in silico, in chemico (métodos químicos), in vitro e información in vivo, permiten aumentar el uso de información de métodos alternativos         para evaluar la toxicidad de una sustancia, minimizando el uso de testeo en animales. Son usados ampliamente, y se plantean como         alternativa para parámetros complejos como sensibilización cutánea o carcinogenicidad (Comisión Europea, 2013; EURL-ECVAM, 2013; Worth y col., 2014). Un ejemplo de estos métodos son los aparatos microfluídicos “body-on-chip”, basados en líneas celulares humanas y métodos computacionales, contienen múltiples cámaras (que representan cada órgano) conectadas mediante conductos de fluidos que representan el flujo de sangre. Son utilizados por ejemplo para el estudio de toxicocinética (Worth y col., 2014).

Tabla 1:Métodos alternativos.

Nombre Descripción Categoría “3 Rs” Estado
Corrosión Cutánea (daño irreversible en la piel, visible necrosis a través de la epidermis hasta la dermis)
Episkin TM Métodos de ensayo basados epidermis humana reconstruida (RhE) Reemplazo Validado por ESAC (1998)
EpidermTM Validado por ESAC (2000)
SkinEthicTM Validado por ESAC (2006)
EpiCSTM(EST-1000) Validado por ESAC (2009)
CORROSITEX® Método de ensayo basado en una membrana sintética  Reemplazo Parcial Validado por ESAC (2000)
Irritación Cutánea (reacción inflamatoria local reversible causada por el sistema inmune innato del tejido afectado)
EpiskinTM Métodos de ensayo basados epidermis humana reconstruida (RhE) Reemplazo Validado por ESAC (2007)
Modified EpidermTM SIT (EPI-200) Validado por ESAC (2008)
SkinEthicTM RHE Validado por ESAC (2008)
LabCyteTM EPI-MODEL24SIT Validado por JaCVAM (2013)
Penetración cutánea (absorción o penetración de una sustancia a través y dentro de la barrera de la piel)
Método in vitro de absorción cutánea  Método de ensayo que usa piel de fuente animal o humana Reemplazo (si usa piel humana) Aceptado por OECD (2004)
Irritación ocular (daño causado por la aplicación de una sustancia en la superficie anterior del ojo, completamente reversible dentro de 21 días de la aplicación)
Fluorescein Leakage Test (FL) Método de ensayo de liberación de fluoresceína en línea celular MDCK (células epiteliales de riñón canino) Reemplazo Parcial Validado por ESAC (2009)
Bovine Cornea Opacity Test (BCOP) Método de ensayo que usa córnea de bovinos obtenidos de mataderos (ex-vivo) Reemplazo Parcial

 

Validado por ESAC (2007)
Isolated chicken eye test  (ICE) Método de ensayo que usa ojo de pollo obtenidos de mataderos de la industria alimentaria (ex-vivo) Reemplazo Parcial

 

Validado por ESAC (2007)
Método de ensayo del microfisiómetro citosensor (CM) Método de ensayo que usa línea celular de ratón Reemplazo Parcial Validado por ESAC (2009)
Genotoxicidad y mutagenicidad: alteraciones genéticas en células somáticas o germinales que pueden causar distintos efectos en la salud tales como envejecimiento prematuro, infertilidad, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, entre otros.
Micronucleus Test (MNT) Ensayo usado para la detección de micronucleos en el citoplasma de células en interface Reducción Validado por ESAC (2006)
Fototoxicidad: respuesta tóxica producida después de la exposición de piel a químico y subsecuente exposición a la luz, o que es inducida por irradiación de la piel tras administración sistémica (oral, intravenosa) de una sustancia química
3T3NRU Phototoxicity Método basado en  línea celular inmortalizada de fibroblasto  de ratón Reemplazo Validado por ESAC (1998)
Toxicidad sistémica aguda (Efectos adversos generales que ocurren después de exposición a una sustancia dentro de 24 horas y durante un periodo de observación de al menos 14 días)
Normal human keratinocyte neutral red uptake (NHK NRU) assay Ensayo basado en células epidermales humanas Reducción Validado por ICCVAM como método adicional a métodos in vivo (2006)
Disrupción endocrina: alteración en la función del sistema endocrino, causando efectos adversos en la salud del organismo o su progenie.
BG1Luc ER TA assay Ensayos basados en línea celular humana Reducción o reemplazo Validado por ICCVAM 2012
Stably
Transfected TA
(STTA) assay
Reducción o reemplazo Aceptado por OECD 2012
Toxicidad para la función reproductora: incluye efectos adversos en función sexual y fertilidad de adultos y efectos adversos en el desarrollo de descendencia.
Embryonic Stem Cell Test for Embryotoxicity (EST) Método que utiliza líneas celulares de ratón Reemplazo parcial Validado por ESAC (2002)
Micromass Embryotoxicity Assay (MM) Método de ensayo que utiliza tejido de animales sacrificados y embriones Refinamiento Validado por ESAC (2002)
Whole rat Embryo Embryotoxicity Test (WET) Método de ensayo que utiliza tejido de animales sacrificados y embriones Refinamiento Validado por ESAC (2002)

Tabla 2: Métodos alternativos en proceso de validación.

 

Nombre Descripción Categoría “3 Rs” Estado
Carcinogenicidad (sustancias carcinógenas inducen tumores, aumentan su incidencia o malignidad, por inhalación, ingestión, aplicación cutánea o inyección).
SHE Ensayo de transformación celular (CTA) en cultivo celular de mamíferos Reemplazo (junto con información preexistente y métodos in silico) Recomendación del ECVAM publicada en 2011
Balb/C Recomendación del ECVAM publicada en 2011
BHAS Recomendación del ECVAM publicada en 2013
Sensibilización cutánea (respuesta alérgica casada por sensibilizante cutáneos al entrar en contacto con la piel (dermatitis alérgica por contacto).
KeratinoSens™ Método de ensayo basado en línea celular humana Reemplazo parcial Recomendación del ECVAM publicada en 2014
Human Cell Line Activation Test
(h-CLAT)
Reemplazo parcial En revisión por pares del ESAC
Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Método basado en péptidos sintéticos Reemplazo parcial Recomendación del ECVAM publicada en 2013
Toxicidad sistémica aguda (Efectos adversos generales que ocurren después de exposición a una sustancia dentro de 24 horas y durante un periodo de observación de al menos 14 días)
3T3 neutral red uptake assay (ensayo de  absorción de rojo neutro) Método de ensayo basado en fibroblastos de ratón Reducción Recomendación del ECVAM publicada en 2013
Toxicocinética (describe como el cuerpo maneja un químico, en función de dosis y tiempo, en términos de absorción, distribución, metabolismo y excreción)
Ensayo de inducción del citocromo P450 (CYP) utilizando la línea celular humana criopreservada HepaRG® así como hepatocitos humanos criopreservados Reemplazo (junto a métodos in silico) Proyecto de validación por ECVAM (2014)

 

 

Irritación Ocular(daño causado por la aplicación de una sustancia en la superficie anterior del ojo, completamente reversible dentro de 21 días de la aplicación)
SkinEthic™ (HCE) Modelo de tejido humano reconstruido Reemplazo (junto con información preexistente) Bajo revisión de ESAC (2013)
EpiOcular™ Eye Irritation Test (EIT)
Disrupción endocrina: alteración en la función del sistema endocrino, causando efectos adversos en la salud del organismo o su progenie.
Ensayo de transactivación del receptor de estrógenos MELN® (protocolos de agonista y antagonista) Basados en línea celular humana Reemplazo parcial Bajo revisión de ECVAM (2013)
Ensayos de transactivación del receptor de andrógenos (protocolos de agonista y antagonista)
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